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DNA测序常见峰图及原因说明

2016-10-29 06:23 作者: 来源: 本站 浏览: 我要评论 字号:

摘要: Q-1.PCR产物电泳检测条带单一,为什么测序结果说模板杂? A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大 小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观,可以直接反应出模板本身的情...

Q-1.PCR产物电泳检测条带单一,为什么测序结果说模板杂?

A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大 小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观,可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是,高质量的 PCR产物才可能得到高质量的测序结果,如果您对PCR产物的纯度不很确定,希望您可以将PCR产物进行克隆处理,以确保得到好的测序结果。以下图为例: 该反应的背景信号较高,不利于碱基的判读。

DNA测序

解决办法:改变PCR条件,重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中,初步筛选后进行单克隆测序。

Q-2.什么是碱基缺失?

A-2.以下图为例:

DNA测序

碱基缺失常见在PCR产物中,特别是从基因组中扩增得到的PCR片段,上图的186位缺失两个连续的T

解决方法:

(1) 使用反向引物继续测序,以矫正缺失位点并达到测通的目的。或者将该PCR产物克隆到质粒中,挑取单克隆测序。

(2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点,那么可以改变PCR反应条件,重新扩增。

Q-3.什么是引物不纯?

A-3.以下图为例:

DNA测序常见峰图及原因说明

引物不纯造成移码现象,该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂,但是引物不纯在峰图上表现的更有规律,一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。

解决办法:重新合成引物,或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。

Q-4.重复结构对测序有哪些影响?

A-4.以下图为例:

DNA测序

解决办法:使用反向引物对模板进行测序,测到该重复结构处,即可完成模板全长的拼接。

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